Překvapivý objev: Jediný nukleotid v RNA spouští fluorescenci pro super-rozlišení živých buněk

Malá molekula RNA zvaná RhoBAST dokáže aktivovat fluorescenční barviva, což vědcům umožňuje sledovat molekuly RNA v živých buňkách s mimořádně vysokým rozlišením.

Malá molekula RNA zvaná RhoBAST dokáže aktivovat fluorescenční barviva, což vědcům umožňuje sledovat molekuly RNA v živých buňkách s mimořádně vysokým rozlišením. Mezinárodní tým vědců, včetně Ronalda Micury a jeho týmu z Institutu organické chemie, nyní odhalil, že za aktivaci fluorescence je zodpovědný malý, lokální „překlopení nukleotidu“ uvnitř RNA.

Fluorescenční „rozsvěcující se“ aptamery (FLAP) jsou krátké sekvence RNA, které se vážou na malé molekuly barviva a aktivují je. Tato barviva by jinak vykazovala jen slabou fluorescenci. Díky tomu je možné geneticky označovat RNA pro zobrazování v živých buňkách bez nutnosti použití proteinových fúzních markerů. Jelikož se barvivo „zapne“ pouze po navázání na RNA, zůstává fluorescence pozadí nízká. Systémy jako Spinach, Broccoli, Mango a Pepper tento princip v posledních letech neustále zdokonalovaly. RhoBAST navíc umožňuje zobrazování jednotlivých molekul RNA v živých buňkách s vysokým rozlišením.

Pro pochopení molekulárního základu těchto pozoruhodných vlastností vědci pod vedením Ronalda Micury z Univerzity v Innsbrucku a Aiminga Rena z Zhejiang University poprvé určili strukturu RhoBAST bez navázaného barviva, stejně jako její struktury v komplexu s TMR-DN a příbuznými barvivy. Výsledky byly publikovány v prestižním časopise Nature Communications.

Výzkumníci objevili překvapivě jednoduchý mechanismus: RhoBAST zaujímá strukturu ve tvaru obráceného písmene V a barvivo se usadí mezi dvěma smyčkami RNA. Když se barvivo naváže, jediný stavební blok RNA – guanosinový zbytek G38 – se „překlopí“ z vnitřní polohy do vnější, čímž vytvoří prostor pro barvivo. Struktura řízená mutageneze a biofyzikální testy, včetně fluorescenční spektroskopie, povrchové plazmonové rezonance (SPR) a kinetiky 2-aminopurinu, prokázaly, že toto dynamické překlopení umožňuje rychlou výměnu ligandu a „blikání“ fluorescence – což je charakteristický znak zobrazování s vysokým rozlišením. Zjištění odhalují dosud nepoznaný mechanismus.

„Je fascinující, že tak malý lokální pohyb uvnitř RNA je klíčový pro pozoruhodné vlastnosti celého systému,“ vysvětluje Micura. „Překlopení jediného nukleotidu umožňuje rychlou výměnu barviva a tím i charakteristické blikání, které je nezbytné pro super-rozlišovací mikroskopii.“ Pochopení tohoto molekulárního spínacího mechanismu poskytuje základ pro vývoj nové generace nástrojů pro zobrazování RNA v živých buňkách s vysokým rozlišením.